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內皮素-3基因啟動子甲基化及其表達在乳腺癌中的臨床意義

【】2016-07-07 點擊次數
基金項目:廣州市醫藥衛生科技項目(編號:20131A011187)
洪曉綠 潘小平 徐沛演:廣州市花都區人民醫院 廣東廣州 510800
通訊作者:潘小平

內皮素-3基因啟動子甲基化及其表達在乳腺癌中的臨床意義

洪曉綠 潘小平 徐沛演
CLINICAL SIGNIFICANCE OF THE MRNA EXPRESSION AND INCIDENCE RATE OF METHYLATION OF ENDOTHELIN-3 PROMOTER IN PATIENTS WITH BREAST CANCER
HONG Xiaolv, PAN Xiaoping, XU Peiyan


  【摘 要】 目的 檢測內皮素-3(EDN-3)基因啟動子甲基化及其表達在乳腺癌組織中的變化,并分析其臨床意義。方法 采用甲基化特異PCR(MS-PCR)和實時定量PCR(RT-PCR)方法檢測42例乳腺癌組織(實驗組)及50例正常乳腺組織(對照組)EDN-3基因啟動子甲基化發生率及其mRNA表達,比較以上兩指標變化在乳腺癌各臨床參數之間的統計學差異。結果 實驗組EDN-3啟動子甲基化檢出率為6429%(27/42),對照組EDN-3啟動子甲基化檢出率為800%(4/50),差異有統計學意義(  2=4217, P<001),該檢出率在患者不同年齡,不同腫瘤組織類型和大小,有否區域淋巴結轉移及遠處轉移之間差異均無統計學意義(P>005)。實驗組EDN-3 mRNA表達較對照組顯著降低,差異有統計學意義(t=-821,P<001),但這種降低在上述不同臨床參數之間差異亦無統計學意義(P>005)。結論 EDN-3基因異常甲基化與乳腺癌密切相關,它能影響其mNRA轉錄水平,對其進行檢測能為乳腺癌的早期診斷和判斷預后提供幫助。
  【關鍵詞】 內皮素-3基因,乳腺癌,甲基化特異PCR

  【Abstract】 Objective To investigate the mRNA expression and methylation of endothelin-3 (EDN-3) promoter in patients with breast cancer and to evaluate the clinical significance. Methods The methylation rates and mRNA expressions of EDN-3 gene in 54 patients with breast cancer (experimental group) and 60 healthy women (control group) were assessed with methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR) and, real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively. Statistical differences of the two index changes in the clinical parameters of breast cancer were compared. Results The detection rate of methylation of EDN-3 promoter was 55.56% (30/54) in experimental group and 8.00%(4/5) in the control group, there were significant differences between those two groups (2=4217, P<001). However there were no statistical differences in terms of the age, tumor size and type, regional lymph node metastasis and distant metastasis (P>005). There were significant differences between the two groups in terms of the expression of endothelin-3 mRNA which significantly decreased in breast cancer patients compared to that of healthy women (t=-8.21, P<001). But there were no statistical differences among all the clinical parameters(P>005). Conclusion Abnormal methylation of EDN-3 promoter is closely correlated to the occurrence and development of breast cancer and could down-regulate the transcription of mRNA of EDN-3, thus providing biomarker for early diagnosis and prognosis of breast cancer. 
     【Key words】  Breast cancer, Endothelin-3, Real-time quantitative PCR, Methylation-specific PCR
     【Author′s address】 People′s hospital of huadu district, Guangzhou, Guangdong, 510800 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.007 

  乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,全球每年約有120 萬女性罹患乳腺癌,且其發病率以每年2%的速度遞增[1],嚴重危害女性身心健康。乳腺癌的發生與多種因素有關,發病機制呈現多元化,包括基因因素和非基因因素[2],某些基因如內皮素(Endothelin,EDN)基因中EDN-1、EDN-2 水平變化可能是乳腺癌發生的分子機制[3],但EDN-3 在乳腺癌的變化情況及其與患者臨床病理狀態的關系少見報道。在前期研究中我們證實EDN-3 mRNA在乳腺癌患者外周血中的表達量顯著減少[4],現本文研究其減少的原因。我們利用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法檢測EDN-3基因啟動子的甲基化情況,同時采用實時定量PCR(RT-PCR)檢測乳腺癌組織中EDN-3 mRNA的表達量情況,探討該表達量的變化是否與乳腺癌患者外周血中的表達量變化相一致。
     1 材料與方法
1.1 一般材料
     選取2013-01-01~2014-10-30在本院接受乳腺手術且經病理學證實為乳腺癌的癌組織42例作為本研究的實驗組,年齡33~69歲,平均(514±112)歲,其中>50歲22例,≤50歲20例。乳腺癌分類參照WHO 2003標準[5],其中腫瘤大小T1 27例,T2~4 15例;組織學分型導管型24例,小葉型18例;無淋巴結轉移(N0)26例,淋巴結轉移(N1~3)16例;無遠處轉移(M0)27例,遠處轉移(M1)17例。另選同期在我院接收乳腺手術(包括乳腺炎;乳腺囊性增生病;乳腺纖維瘤;乳腺管內或囊內乳頭狀瘤)且經病理學證實為非乳腺癌的乳腺組織50例作為對照組,年齡23~58歲,平均(389±123)歲,兩組間年齡差異不具有統計學意義(t=0821,P=0626),具有可比性,所有組織經手術切除后置于-80 ℃保存備用。
1.2 主要儀器及試劑
     普通PCR儀(C1000 Thermal cycler,BIO-RAD),熒光定量PCR儀(7300,ABI),制冷機(AF100,Scotsman),凝膠成像系統(Transilluminator M-26,UVP)。Trizol [Invitrogen(9109)],DEPC(Sigma),PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑盒(TaKaRa),SYBR RT-PCR試劑盒(TaKaRa),DNA 提取試劑盒(廣州,捷倍斯),甲基化試劑盒(Active Motif)。
1.3 引物設計與合成
     采用Methyl Primer express V10 軟件設計EDN-3甲基化(EDN3-M)和EDN-3非甲基化(EDN3-U)引物,所有序列均在ABI 3900臺式高通量DNA合成儀(Invitrogen公司)上合成。各種引物序列見表1。

表1 實驗所用引物序列


  Sequence (5′3′) T/℃ Cycles products/bp
EDN3-U  Forward:TTTGGGAGGTGATTTTTAGTGTGTTT 60 40 144
   Reverse: ACCCATCCCTACACAAAACTAACCA
EDN3-M  Forward: TGGGAGGCGATTTTTAGTGCGTTC 60 40 140
   Reverse: CCATCCCTACGCGAAACTAACCG

1.4 DNA提取及甲基化修飾
     各取10g左右實驗組及對照組組織,按照DNA 提取試劑說明書提取組織中總DNA,隨后采用Wash Buffer連續洗滌2次,提純DNA,取1 μL DNA樣品50倍稀釋,在紫外分光光度儀上測定A(260)/A(280)值為18~20,純度較高。每例DNA標本取1 μg按照甲基化試劑盒說明書進行修飾,經修飾后的DNA中,未甲基化的胞嘧啶(C)被氧化性脫氨基后變成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不變。-80 ℃保存備用。
1.5 MS-PCR
     配制30 μL MS-PCR反應體系,其中DNA 4 μL,dNTPS 05 μL,Taq酶 02 μL,10×PCR buffer 3 μL,Forward primer (10 pmol/μL) 15 μL,Reverse Primer (10 pmol/μL) 15 μL,H2O 193 μL。反應條件為:93 ℃ 5 min;然后93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共40循環;72 ℃ 7 min。取產物10 μL,2%瓊脂糖凝膠電泳120 V×40 min,凝膠成像系統觀察結果。
1.6 RT-PCR 
     使用Trizol 試劑分別提取實驗組及對照組組織中總RNA,隨后采用RNase-free的DNase Ⅰ(Promega)試劑將總RNA提純。按照本實驗室建立的反應體系及擴增條件進行RT-PCR[6],檢測實驗組及對照組組織中EDN-3 mRNA的表達。
1.7 統計學處理
     計量資料采用均值±標準差(±s)表示,均經正態性檢驗和方差齊性檢驗,計量資料之間的比較采用t檢驗,計數資料比較采用卡方檢驗,檢驗水準α=005。采用SPSS 130進行統計分析。
2 結果
2.1 實驗組與對照組END-3啟動子甲基化檢出率之間的比較
     MS-PCR結果包括甲基化、未甲基化和部分甲基化三種(見圖1),部分甲基化病例歸為甲基化進行統計。實驗組中檢測出甲基化20例,部分甲基化7例,未甲基化15例,總甲基化檢出率為6429%(27/42),而對照組中檢出部分甲基化4例,未甲基化46例,總甲基化檢出率為800%(4/50),兩組甲基化檢出率差異具有統計學意義(  2=4217,P<001)。這種高EDN-3啟動子甲基化檢出率在患者臨床病理狀態,包括患者年齡、腫瘤組織類型和大小、有否區域淋巴結轉移及遠處轉移之間比較差異均無統計學意義(P>005,見表2)。
2.2 乳腺癌組織中EDN-3 mRNA的表達及臨床各參數之間的比較
     結果顯示,實驗組EDN-3 mRNA的表達量((5712±1316)×103 copies/μL)較對照組((45231±25379)×103 copies/μL)明顯降低,差異具有統計學意義(t=-821,P<001)。但這種降低在不同臨床參數,包括患者年齡、腫瘤組織類型和大小、有否區域淋巴結轉移及遠處轉移之間比較差異均無統計學意義(P>005,見表3)。


注:1為甲基化內參;2為非甲基化內參;3、4為完全甲基化樣本;5、6為部分甲基化樣本;7、8為完全未甲基化樣本;9、10為無菌雙蒸水;M:甲基化引物MS-PCR后電泳條帶;U:非甲基化引物MS-PCR后電泳條帶

圖1 MS-PCR檢測結果電泳圖

表2 不同臨床參數乳腺癌患者EDN-3
啟動子甲基化檢出率比較

n(%)

臨床參數 總例數 甲基化   2 P
年齡/歲
 ≤50 20 13(65.00) 3.524 0.318
 >50 22 14(63.64)
組織類型
 導管型 24 16(66.67) 4.667 0.198
 小葉型 18 11(61.11)
腫瘤大小
 T1 27 19(70.37) 5.571 0.062
 T2~4 15 8(53.33)
區域淋巴結轉移
 N0 26 16(61.54) 5.81 0.121
 N1-3 16 11(68.75)
遠處轉移
 M0 27 18(66.67) 4.545 0.103
 M1 17 9(52.94)

表3 乳腺癌患者不同臨床參數間EDN-3 mRNA
表達比較

×103copies/ μL, (±s)

臨床參數 總例數 EDN-3 mRNA t P
年齡(歲)
 ≤50 20 6.032±1.625 3.152 0.131
 >50 22 5.161±1.412    
組織類型
 導管型 14 5.855±1.153 1.367 0.622
 小葉型 18 5.379±1.427    
腫瘤大小
 T1 27 5.659±1.637 1.104 0.811
 T2~4 15 5.733±1.688    
有否區域淋巴結轉移
 N0 26 5.914±2.103 1.742 0.267
 N1~3 16 5.263±1.562    
遠處轉移
 M0 27 5.857±1.963 2.965 0.094
 M1 17 4.688±1.742

3 討論
     EDN-3是EDN家族(EDN-1,EDN-2,EDN-3)成員之一,通過自分泌和旁分泌的方式與細胞表面的EDN-A (EDNRA) 和EDN-B (EDNRB)受體相互作用[7],參與細胞的生物功能,如細胞的增殖、分化以及誘導細胞轉移等[8]。我們的研究證實,EDN-3與乳腺癌的發生密切相關[4]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,是由 DNA 甲基轉移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基轉移至胞嘧啶含氮雜環5 ′位上的修飾反應[9],與腫瘤的發生發展相關[10]。DNA甲基化在腫瘤基因表達調控、細胞增殖分化等方面起著重要的作用,并與腫瘤的發生密切相關,已證實DNA甲基化與許多腫瘤和疾病有關,如前列腺癌[11]、胃癌[12]、肝細胞癌[13]、2型糖尿病[14]等。DNA的甲基化可作為某些疾病的診斷依據[15]。
     乳腺癌的發生與許多基因的甲基化有關[16],在我們的研究中證實乳腺癌患者外周血中存在EDN-3 基因異常甲基化情況[6],在本研究中,42例乳腺組織中檢測出27例EDN-3基因的甲基化,甲基化檢出率為64.29%(27/40),顯著高于正常乳腺組織EDN-3 基因的甲基化檢出率(8%(4/50)),進一步證實無論在乳腺癌患者的乳腺組織中還是在乳腺癌患者外周血中均存在EDN-3 基因的甲基化情況,這些均與乳腺癌的發生密切相關。WIESMANN F等[17]證實EDN-3啟動子甲基化是乳腺癌患者預后不良的獨立因素,故早期檢測乳腺癌組織或外周血中EDN-3基因的甲基化狀況,可為乳腺癌的監測和早期診斷提供依據。MIYAHARA [18]證實大多數脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶,主要集中在基因5′端的非編碼區,并成簇存在,因此,在本研究中也能在50例正常乳腺組織中檢測出4例EDN-3 基因的部分甲基化,甲基化檢出率為8%(4/50),但這種部分甲基化的DNA并不影響其轉錄水平。
     實時定量PCR結果顯示實驗組EDN-3 mRNA的表達量較對照組明顯降低,差異具有統計學意義(t=-821,P<001)。提示,EDN-3基因異常甲基化,導致EDN-3基因的失活,從而阻斷了EDN-3基因的正常轉錄,該結論與EDN-3基因在乳腺癌外周血中的表達關系一致。
     綜上所述,EDN-3基因異常甲基化可能影響其mRNA轉錄的轉錄水平,EDN-3基因啟動子的甲基化可能參與乳腺癌的發生,臨床上對其進行甲基化檢測有助于乳腺癌的早期診斷和預后判斷,可能為乳腺癌的診斷和治療開辟新的途徑。

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