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雌激素受體β過表達對三陰乳腺癌細胞生物學行為的影響

【】2016-07-07 點擊次數
基金項目:廣東省醫學科研基金(編號:B2012191),廣東省科技計劃項目(編號:2013B02200017)
鄭少峰 黃貴和 羅澤斌 黃楚君:汕頭市朝陽區大峰醫院 廣東汕頭 515154
劉瑞磊:中山大學附屬第三醫院 廣東廣州 510630
通訊作者:劉瑞磊

雌激素受體β過表達對三陰乳腺癌細胞生物學行為的影響

少峰 黃貴和 羅澤斌 黃楚君 劉瑞磊
EFFECT OF ERβ′S OVER-EXPRESSION ON TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELL BIOLOGICAL BEHAVIOUR
ZHENG Shaofeng, HUANG Guihe, LUO Zebin, et al


  【摘 要】 目的 檢測ERβ在三陰性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)及癌旁組織中的表達,探討其對TNBC細胞生物學行為的影響,揭示其在TNBC發生發展中的作用。方法 免疫組化法檢測ERβ在TNBC及癌旁組織中的相對表達量,將ERβ轉入低表達的TNBC細胞MDA-MB-435s中,通過 MTT 試驗、Transwell 小室侵襲實驗及軟瓊脂集落形成實驗,檢測MDA-MB-435s生物學行為的變化。結果 ERβ在TNBC組織中仍有表達,表達率高達38.33%,在對應的癌旁組織中,表達率為51.67%。ERβ過表達后MDA-MB-435s細胞的增殖和侵襲能力下降,成瘤能力也下降。結論 ERβ在TNBC組織中仍有表達,表達率低于癌旁組織,在TNBC細胞的增殖、侵襲和遷移中起負性調節作用,可作為預測TNBC預后的分子標志物及基因治療的靶點。
  【關鍵詞】 ERβ,三陰性乳腺癌,侵襲,遷移

  【Abstract】 Objective To detect the expression of ERβ in triple-negative breast cancer(TNBC) and para-carcinoma tissue. And to discuss the effect of ERβ on TNBC cell biological behaviour and to reveal its function in the occurrence and development of TNBC. Method The relative expression of ERβ in TNBC and para-carcinoma tissue was detected by IHC, and ERβwas transferred to TNBC cell line MDA-MB-435s where ERβ is under-expressed. MDA-MB-435s′ biology behavior changes were detected through the MTT test, transwell cell invasion assay and Colony formation test. Result The expression rate of ERβ was as high as 38.33% in TNBC tissue, and 5167% in para-carcinoma tissue. The over expression of ERβ inhibited the proliferation, invasion and tumor formation of MDA-MB-435s cell. Conclusion ERβ has a lower expression rate in TNBC tissue than in para-carcinoma tissue which could negatively regulate the proliferation, invasion and migration of TNBC and taken as the molecular maker of predicting TNBC prognosis and target of new therapy for TNBC.
     【Key words】 ERβ, Triple-negative breast cancer, Invasion, Migration
     【Author′s address】 Dafeng hospital, Chaoyang district, Shantou, Guangdong, 515154 PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.005 

  乳腺癌是一種高度異質性的腫瘤,Perou和Sorlie等[1-2]根據分子表型將乳腺癌分為5類:Lumina1 A、Luminal B、Normal Breast Like、C-erB-2(HER2)及Basal-like乳腺癌。這幾類乳腺癌在分子生物學特征、組織形態、免疫表型還是對治療的反應上都存在著極大的差異。基因表達譜芯片檢測發現,Basal-like乳腺的表達譜特征為ER、PR和HER2這三種受體基因表達缺失,p53表達,BRCA1和P53基因突變,而EGFR、Ki-67和cyclin D等細胞增殖相關基因表達上調[3],因此臨床上將ER、PR和HER2表達陰性的這類乳腺癌稱為三陰乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)。
     TNBC的臨床特征為原發腫瘤體積大,臨床分期晚,組織形態學特點為腫瘤細胞增殖活性高和侵襲能力強。與其它類型的乳腺癌相比,TNBC遠處轉移率高,易轉移至肺臟和肝臟等內臟器官[4]。由于TNBC缺乏內分泌治療及針對HER2的分子靶向治療的相應靶點,治療手段較為匱乏,預后生存較非TNBC差[5],成為乳腺癌治療中的難點。
     雌激素在雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)陽性乳腺癌的發生、發展中起著重要的作用, ER的表達狀況對判斷乳腺癌預后及指導乳腺癌的內分泌治療具有重要意義。ERα作為經典的ER, 通常認為其陽性表達者預后較好, 1997年成功地克隆鑒定了第二個雌激素受體: ERβ后,關于ERβ對乳腺癌的作用和在內分泌治療中的地位成為了新的研究熱點。
       多個實驗證實在多數ERα陰性和三陰乳腺癌患者中仍有ERβ表達。ERβ與遠處轉移減少相關,是ERα陰性乳腺癌的獨立預后因素。在某些腫瘤的體外細胞實驗中,ERβ過表達已被證實能抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡。那么ERβ對TNBC細胞的增殖和凋亡是否存在影響呢?本研究將選用ERβ低表達的TNBC細胞株MDA-MB-435s,采用脂質體轉染,建立ERβ穩定高表達的細胞株。觀察ERβ對TNBC細胞增殖凋亡以及侵襲轉移能力的影響。以探討其在乳腺癌發生發展過程中的作用。
     1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 臨床資料 經患者知情同意,隨機選取中山大學附屬第三醫院2007年1月~2014年10月病理證實為TNBC行乳腺癌手術治療的手術標本60例,并取癌旁正常乳腺組織標本60例,年齡33~69歲,中位年齡51.0歲,患者全部為女性。
1.1. 2 細胞 人乳腺癌細胞系MDA-MB-435s購自美國典型細胞培養庫(ATCC)。
1.1. 3 試劑 鼠抗人ERβ單克隆抗體購自Abcome 公司,DMEM培養基、胎牛血清購自Hyclone公司,胰蛋白酶購自GIBCO 公司,Western blot 用兔抗人多克隆抗B-actin 抗體、羊抗兔和兔抗鼠二抗購自中杉金橋生物技術有限公司,限制性核酸內切酶(BamH I和Hind III)、T4 DNA連接酶、dNTP等購自Fermentas公司,DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司,脂質體Lipofectamine 2000TM 及Trizol購自Invitrogen 公司,G418等化學試劑購自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫組化法檢測ERβ在TNBC患者腫瘤及癌旁組織中的表達 取經福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊,4 μm連續切片,烤片2 h后經二甲苯連續脫蠟三次。梯度酒精水化。EDTA抗原修復后滴加3%過氧化氫,阻斷內源性過氧化物酶。PBS漂洗后加一抗孵育過夜(4 ℃),PBS漂洗后加二抗,室溫下孵育45 min,DAB室溫下顯色,蘇木素復染,中性樹膠封片。ERβ陽性染色定位于細胞核。隨機計數5個高倍視野, 按陽性率=陽性細胞數÷癌細胞總數×100%計算每個高倍視野中陽性細胞所占比例,取其平均值為該張切片的表達水平。ERβ陽性細胞>25%者記為為陽性,見圖1A,≤25%計為陰性,見圖1B。


注:1A ERβ陽性( En Vision 二步法 ×200);1B ERβ陰性( En Vision 二步法 ×200)

圖1 ERβ在TNBC中的表達
1.2.2 pEGFP-C1/ERβ真核表達載體的構建 以Trizol試劑法提取ERβ陽性表達的人乳腺癌細胞株MCF-7總RNA。以總RNA為模板, Oligo(dT)為引物,將mRNA反轉錄為cDNA,利用ERβ引物(分別引入限制性內切酶BamH I和Hind III酶切位點)擴增出ERβ序列。上游引物5′-GATGCTTTGGTTTGGGTGAT-3′,下游引物5′-CTTGTTACTCGCATGCCT-3′。以限制性內切酶BamH I和Hind III消化PCR產物, DNA回收試劑盒回收目的片段,將ERβDNA片段插入經相同限制性內切酶消化、回收的真核表達載體pEGFP-C1。連接產物轉化E.coli DH5α擴增后,提取細菌中的質粒,酶切鑒定后送華大基因公司測序。成功構建真核表達載體pEGFP-C1-ERβ。
1.2.3 pEGFP-C1/ERβ質粒轉染、篩選及鑒定 取對數生長期人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s以2×105個/孔接種于6孔板,以正常MDA-MB-435s細胞為對照, 按Lipofectamine2000TM操作說明書,分別轉染pEGFP-C1 (空質粒)和pEGFP-C1-ERβ。 4~6 h后, 棄去轉染液,更換2 mL含10%胎牛血清的培養液繼續培養。48 h后以750 mg/L的G418的培養液進行篩選, 約16 d后對照MDA-MB-435s細胞全部死亡, 轉染組改用200 mg/L的G418的培養液, 將陽性克隆擴大培養后, 建立穩定傳代的轉染細胞系。
1.2.4 Western-blotting法鑒定ERβ在轉染細胞中的表達 收集MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ細胞蛋白,將 50 μg 樣本加在 8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠孔中, 80 V電壓電泳跑膠,110 mA 電流轉膜。轉膜后用脫脂奶粉封閉 2 h(室溫),洗膜后加入ERβ單克隆抗體(1∶ 300)和β-actin(1∶ 500),4 ℃條件下孵育過夜,復溫并洗滌后二抗孵育1 h(室溫),用化學發光試劑盒Thermo進行曝光,電泳凝膠成像分析儀采集圖像。
1.2.5 MTT法檢測細胞活性 將MDA-MB-435s、MDA-MB-435s-pEGFP-C1、MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ細胞以2×104個/孔的密度接種于96 孔板中,在恒溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養,設5個平行孔。分別于第1~7天加入100 μL 5 mg/mL甲基噻唑基四唑(MTT) 工作液,孵育4 h后棄去上清,加入100 μL二甲基亞砜( DMSO)溶解MTT還原物,震蕩15 min,用酶聯免疫儀檢測波長為490 nm處的吸光度數值,實驗重復3次,取均值。以時間為橫坐標,A490值為縱坐標,繪制曲線,評估細胞增殖情況。
1.3 Transwell侵襲實驗
       在Transwell 小室上室面加入50 μL按比例混合的Matrigel 與DMEM培養基,置于37 ℃凝固。取對數生長期的MDA-MB-435s-pEGFP-C1和MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ細胞計數后,加入含5%胎牛血清的DMEM培養基,配成2×105 /mL的細胞懸液,上室每孔加入100 μL細胞懸液,下室加入含10%胎牛血清的培養基。37 ℃培養箱中孵育24 h,取出小室,用棉簽拭去Matrigel 膠。95%甲醇室溫下固定20 min,風干,0.25%結晶紫染色,風干后,置于顯微鏡下計數并拍照。
1.4 軟瓊脂集落形成實驗
       按1∶ 1比例將0.7% 瓊脂與2×DMEM培養液按混合, 加入對數生長期的MDA-MB-435s-pEGFP-C1和MDA-MB-435s-pEGFP-C1-ERβ細胞懸液, 充分混勻,制成密度為2×103/mL的混懸液, 每孔1 mL注入到含0.6%瓊脂的六孔板中, 瓊脂凝固后, 將六孔板置于恒溫37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的細胞培養箱中, 培養2 w。用0. 2% 的p-iodonitrotetrazolium violet染色后置于顯微鏡下觀察集落形成并拍照。
2 結果
2.1 ERβ在TNBC患者腫瘤及癌旁組織中的表達
       60例TNBC組織標本中, ERβ陽性表達的為23例(38.33%),對應60例癌旁組織中ERβ陽性表達的為31例(51.67%),顯著高于癌組織中的陽性表達率。
2.2 穩定高表達ERβ細胞株的篩選及鑒定
       用脂質體的方法轉染ERβ至人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s中, 經G418篩選, 并通過Western blotting進行鑒定。以親代細胞MDA-MB-435s和轉染空載體的細胞MDA-MB-435s-pEGFP-C1作為對照。獲得ERβ蛋白高表達克隆,見圖2。

 

圖2 穩定轉染ERβ基因的MDA-MB-435s 細胞中ERβ表達量增高
2.3 ERβ抑制TNBC細胞的生長
       通過MTT法繪制三組細胞生長曲線以觀察ERβ對細胞增殖的影響。與MDA-MB-435s細胞及轉染空質粒的細胞MDA-MB-435s-pEGFP-C1相比,轉染ERβ的MDA-MB-435s細胞其生長速度下降,見圖3。
2.4 ERβ對TNBC細胞侵襲能力的影響
       通過計數穿過微孔膜的細胞數量來衡量細胞的侵襲能力。與轉染空載體的細胞相比, 轉染ERβ的MDA-MB-435s細胞穿過transwell微孔膜的細胞數量明顯下降,細胞的侵襲能力明顯降低,見圖4。

 

圖3  ERβ的表達對MDA-MB-435s細胞增殖能力的影響

 

圖4 ERβ的表達對MDA-MB-435s細胞侵襲能力的影響
2.5 ERβ對TNBC細胞成瘤能力的影響
       軟瓊脂集落形成實驗顯示, 與轉染空載體的細胞相比, 轉染ERβ的MDA-MB-435s細胞形成的集落明顯減少,說明ERβ可抑制TNBC細胞的錨定非依賴性生長能力。
3 討論
       TNBC好發于30~40歲的絕經前婦女、體質量指數較高的絕經前婦女、腰臀比較高的圍絕經期女性,以及有乳癌家族史或BRCA1基因突變失活的女性[6-8]。TNBC的治療目前仍主要依靠化療,由于大多數TNBC 存在BRCA1基因的突變,而體外研究證實鉑類藥物、絲裂霉素、依托泊苷和博來霉素等對BRCA1 基因突變的乳腺癌敏感[9],所以有學者認為大劑量化療能給TNBC患者帶來更大的生存獲益[10]。在分子靶向治療方面,現有的研究發現PARP(一種DNA 修復酶)可能是TNBC新的治療靶點,而其它靶向藥物如貝伐單抗(Bevacizumab, Avastin)西妥昔單抗(Cetuximab)等僅有小范圍的臨床試驗[11-12]結果并不令人滿意。現在針對TNBC的化療藥物和靶向治療藥物還無法在大樣本、前瞻性、多中心臨床試驗中得到驗證,同時還存在著副作用大或價格昂貴等缺點,因此,尋找潛在有效的治療靶點,解決TNBC治療效果不佳的難點,具有重要的意義。
       人類ERβ基因位于染色體14q23-24.1,由530個氨基酸構成[13]。ERα和ERβ通常在大多數正常乳腺組織、乳腺癌和乳腺癌細胞株中共同表達,但某些乳腺癌細胞只表達ERβ,也有乳腺癌細胞兩種受體都不表達[14]。ERβ在許多ERα陰性和TNBC細胞中表達,提示ERβ在雌激素信號通路和三陰乳腺癌的發病機制中發揮作用。但是其表達水平的高低對TNBC細胞增殖和凋亡的影響還沒有定論,與相關生理病理指標的關系以及它在臨床內分泌治療中的地位還有很多不一致的結果。在非乳腺癌腫瘤中的研究發現ERβ是一個重要的抑癌因子,在腫瘤細胞中表達明顯減少[15]。ER除了通過與雌激素結合這種配體依賴性的方式調節轉錄翻譯外,還可以在無雌激素作用時以配體非依賴性方式調節轉錄翻譯[16]。在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中也觀察到ERβ以雌激素非依賴的方式抑制腫瘤細胞增殖或誘導凋亡[17-19]。可見應用各種ERβ受體激動劑或小干攏RNA來研究ERβ受體的作用,明確它所涉及的有關下游機制,在治療TNBC的研究中具有很大的價值。
       本研究采用免疫組化法檢測ERβ在TNBC及癌旁組織中的表達情況,并分析其在兩種組織中的表達差異,以及ERβ高表達對TNBC細胞的增殖、侵襲、錨定非依賴性生長能力的影響,研究表明,ERβ過表達后,TNBC細胞MDA-MB-435s的增殖能力明顯下降,同時,穿膜能力和錨定非依賴性生長能力均大幅度下降。以上研究結果表明, ERβ的高表達可對TNBC細胞增殖、侵襲及遷移起到抑制作用,在TNBC的發生發展中發揮著重要的作用,為TNBC的基因治療提供了可靠的實驗依據。
       綜上所述, ERβ的表達與TNBC的發生發展密切相關,其表達缺失可能是TNBC癌變過程中的早期事件。隨著對其功能研究的進一步完善,ERβ必將成為診斷和預測TNBC預后的分子標志物和抗TNBC侵襲和轉移的生物治療新靶點,為TNBC的治療提供新的突破口。

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(下轉第16頁)(上接第12頁)
評價視角上,局部關注得較多,整體關注少。在對醫學大學生以及在崗醫務人員人文素質評價研究的方面,大多數文獻都是對某所大學、某幾家地方醫院進行評價,沒有對影響醫學生以及在崗醫務人員的綜合素質的因素等問題進行深入的分析;②在評價方法上,多數研究運用的方法仍然較單一,不能克服其在評價中的某些缺陷,存在局限性,少有研究應用不同評價方法綜合評價;③在評價內容上,缺乏創新發展性人文素質的評價,現有文獻研究的評價內容遠不能滿足當代醫學生評價的要求,醫學生人文素質的評價內容應針對素質、能力、個性培養;④在選取評價指標上,多數文獻采用專家咨詢的方式,憑經驗較多,缺乏支持指標數據之間的相關性的研究證據;各指標權重分配的主觀性、隨意性比較大,缺乏規范性和科學性。
     綜上,醫學生人文素質的評價過程是漫長而復雜的,開展人文素質評價方法研究的當務之急就是研究醫學生人文素質教育評價理論依據,明確人文素質內涵,規范評價標準,建立可操作性的醫學生人文素質評價體系,促進當前醫學院校、醫療單位盡早形成規范的人文素質評價機制。

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