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磁性碳納米管載附5-FU對胃癌淋巴結轉移模型抑制作用研究

【】2016-07-05 點擊次數

基金項目:江西省教育廳青年基金資助項目(編號:GJJ13040)
金彥召 曹家慶 胡小云 毛盛勛 沈 威 賈驚宇 李正宇 辛 林:南昌大學第二附屬醫院 江西 南昌 330006

磁性碳納米管載附5-FU對胃癌淋巴結轉移模型抑制作用研究

金彥召 曹家慶 胡小云 毛盛勛 沈 威 賈驚宇 李正宇 辛 林
INHIBITORY EFFECT OF MAGNETIC CARBON NANOTUBES LOADED WITH 5-FU VEHICLE IN LYMPH NODE METASTASIS MODEL OF GASTRIC CANCER
JIN Yanzhao, CAO Jiaqing, HU Xiaoyun, et al


  【摘 要】 目的 觀察磁性多壁碳納米管在胃癌淋巴結化療中的作用。方法 MTT法檢測mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml)對胃癌SGC7901細胞的抑制作用。將mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml)分別注入SD大鼠足墊皮下及胃癌淋巴結轉移裸鼠體內。結果 體外mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml),經稀釋(10-10000)倍后,相同5-FU濃度時兩者對體外SGC7901細胞的抑制作用無顯著性差異, 說明主要藥物成分是5-FU。結論 體內研究提示mMWNTs-5-FU能有效聚集在淋巴結,淋巴結濃集效果明顯優于5-FU(p<0.05),并能緩慢控制釋放,且不良反應小;mMWNTs-5-FU化療后胃癌淋巴結轉移灶癌細胞有明顯凋亡現象,說明mMWNTs-5-FU對胃癌SGC7901細胞淋巴結轉移有明顯抑制作用。
  【關鍵詞】 磁性多壁碳納米管,淋巴靶向化療,胃癌,淋巴結轉移

  【Abstract】 Objective To observe the effect of magnetic multi-walled carbon nanotubes in chemotherapy of lymph node of gastric cancer. Methods MTT assay was adopted to measure the inhibitory effects of different concentrations (diluted 10-10000 times) of mMWNTs(3 mg/ml), mMWNTs-5-FU(3 mg/ml~12 mg/ml), 5-FU(12 mg/ml) on the growth of SGC7901 cells. mMWNTs(3 mg/ml), mMWNTs-5-FU(3 mg/ml~12 mg/ml) and 5-FU (12 mg/ml) were injected into subcutaneous footpad of SD rat and lymph node metastasis of gastric cancer in nude mice. Results After dilution (diluted 10-10000 times) of mMWNTs(3 mg/ml), mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml) and 5-FU (12 mg/ml) in vitro, the inhibitory effect had no significant difference among the same concentration of 5-FU on SGC7901 cells, which indicated that the main ingredient was 5-FU. Conclusion In vivo studies indicate that mMWNTs-5-FU can effectively gather in the lymph nodes, whose lymph-node concentration effect is obviously better than that of 5-FU (p<0.05), with a slow controlled release and fewer adverse reactions. The obvious cell apoptosis of lymph node metastasis cells after the mMWNTs-5-FU chemotherapy, indicates that mMWNTs-5-FU has a significant inhibitory effect on SGC7901 cells of lymph node metastasis of gastric cancer.
     【Key words】  Magnetic multi-walled carbon nanotubes, Lymph node targeted chemotherapy, Gastric cancer, Lymph node metastasis.
     【Author′s address】 Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.07.002

  淋巴道轉移是胃癌主要的轉移途徑,除了手術對淋巴的廓清,全身靜脈化療很難在局部淋巴結保持有效的藥物濃度,治療效果不理想。淋巴靶向化療概念的提出,有效解決的這個難題,將化療藥物通過淋巴靶向載體在淋巴結高效濃集,保持淋巴道內有效的化療藥物濃度,殺滅癌灶,而血液內及重要臟器內藥物濃度較低,減輕全身毒副作用。本研究前期將納米級氧化鐵磁性成分、多壁碳納米管、抗腫瘤藥物5-FU結合起來,制備成磁控靶向藥物傳遞系統,通過體外、體內實驗研究發現其對結腸癌淋巴結轉移有一定抑制作用,本研究旨在進一步探討磁性碳納米管載附5-FU對胃癌淋巴結轉移模型抑制作用。
     1 材料和方法
     設計:實驗性研究。
     時間及地點:2013年9月~2015年1月,南昌大學第二附屬醫院分子中心實驗室、基礎醫學院動物科學部。
     材料:
1.1 試藥與材料
     磁性多壁碳納米管(mMWNTs),北京博宇高科新材料公司;5-氟尿嘧啶(5-FU):德國Ruibio(進口分裝);pvp k30: 德國BASF(進口分裝);SD 大鼠;BALB/cA裸小鼠,4~5周齡, 雌雄各半,體質量21.50~25.70 g,均購自南昌大學實驗動物科學部;SGC7901細胞株為同行轉贈。
1.2 實驗方法
1.2.1 載藥體系的構建 mMWNTs、PVP-K30及5-FU,按實驗要求比例加入去離子水,35℃,40kHz超聲分散4h,得到黑色穩定的磁性碳納米管混懸液及磁性碳納米管載附5-氟尿嘧啶混懸液。紫外分光光度法測定載附5-FU劑量。
     上述方法配制以下藥物。
1.2.2 體外對胃癌細胞的殺傷效應 將mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml)及空白組加入進入對數生長期的胃癌SGC7901培養基中,觀察其在24 h、48 h和48 h對細胞的抑制率。
1.2.3 體內對淋巴結轉移的抑制作用 建立裸鼠胃癌淋巴結轉移模型,選取五周后左側腘窩淋巴結直徑0.5 cm大小時備用。
     淋巴結轉移模型隨機分為6組,每組7只,共42只,A組-生理鹽水組、B組-5-FU單藥組、C組-mMWNTs(3 mg/ml)空白載體組、D組-低濃度不加磁場mMWNTs-5-FU(3 mg/ml~12 mg/ml)組、E組-加磁場mMWNTs-5-FU(3 mg/ml~12 mg/ml)組,均于足墊0.1 ml劑量注射,1、7天給藥方案化療,左下肢足墊皮下給藥,化療21天處死裸鼠,按照公式淋巴結腫瘤和瘤體體積生長抑制率=(1-治療組平均體積/對照組平均體積)×100%,檢測血白細胞和肌酐。1~8天取腘窩淋巴結高效液相檢測淋巴結5-FU緩慢釋放情況,TUNNEL法檢測細胞凋亡率。
     統計方法:數據表示為平均值±標準差(±s)。這項研究數據統計分析用SPSS13.0軟件,p值<0.05,被認為有統計學意義。統計圖形用GraphPad Prism 5.0繪制。
     2 結果
2.1 mMWNTs表征數、分散及淋巴結示蹤情況
     成品mMWNTs的相關指標見下圖;配置成混懸液后,室溫下,分散比較均勻,呈現黑色,四周后有少許分層,輕輕震蕩后后,又分散均勻,超聲分散后可恢復原狀,外磁場作用下有很好的磁順應性,SD鼠足墊注射用,各站淋巴結黑染示蹤效果好。全身心、肝、腎、肺病理HE未見碳納米管。而且對5-FU有好的載附效果。

圖1 mMWNTs表征數、分散及淋巴結示蹤情況 

表1 紫外分光光度法測定mMWNTs載附5-FU劑量

 

mMWNTs度
(mg/ml)
吸光度
(A)
游離濃度
(mg/ml)
吸附量
(mg)
單位吸附量
(mg/mg)
1.25 0.023 0.544 0.652 0.026
2.5 0.053 1.103 1.175 0.047
3.75 0.081 1.616 2.075 0.083
5 0.092 1.834 5.325 0.213
6.25 0.114 2.240 7.075 0.283
7.5 0.142 2.756 7.950 0.318
8.75 0.171 3.284 8.725 0.349
10 0.202 3.866 3.866 0.363
11.25 0.196 3.749 3.749 0.605
12.5 0.251 4.784 4.784 0.469

2.2 mMWNTs、mMWNTs-5-FU對體外SW480細胞的抑制作用
     將mMWNTs(3 mg/ml)、mMWNTs-5-FU(3 mg/ml-12 mg/ml)、5-FU(12 mg/ml)稀釋到不同倍數,發現mMWNTs的濃度高達3 mg/ml與0.0003 mg/ml時,對胃癌SGC7901細胞的殺傷都不明顯,但與含有5-FU的兩組相比,其殺傷力明顯較低,細胞抑制率明顯較低(p<0.05)。含有5-FU兩組對細胞的抑制率與5-FU有關,但mMWNTs-5-FU組殺傷效應強于5-FU組,但無統計學差異(p>0.05)。

圖2 各組藥物對胃癌SGC7901細胞的抑制率
2.3 mMWNTs、mMWNTs-5-FU體內研究
     裸鼠胃癌淋巴結模型成瘤率為90%,胃癌轉移淋巴結經病理HE證實,給藥前及給藥后三周小鼠的體重和腫瘤體積變化見表4-1所示,結果顯示給藥前和給藥后各組間小鼠體重變化差異不大。C、D及E組與A、B兩組之間比較治療后腫瘤體積的變化,C、D及E腫瘤體積明顯有減小,但四組間腫瘤體積減少無明顯差別。第21天摘取左側腘窩淋巴結,計算質量和體積抑制率,兩者成線性相關,R2=0.864,B組淋巴結質量和體積較A組明顯增高(p<0.05),E組淋巴結質量和體積較A組明顯降低(p<005),與C組比較淋巴結質量和體積也明顯降低(p<0.05)。5-FU組小鼠的白細胞低于正常范圍,與D及E組比較差異有顯著意義(p<0.05)。

表2 各化療組AI及IHC陽性指數(平均值±標準差)

 

  組別 AI(%) IHC陽性指數
A 0.034±0.006 96372.5±5746.8
B 0.139±0.031 65784.6±9875.4
C 0.077±0.017 57642.8±5437.6
D 0.163±0.032 59657.2±7986.5
E 0.230±0.073 39876.2±6984.9

  表3 淋巴結藥物濃度(平均值±標準差)

單位(ug/g)

時間 5-FU單藥組 mMWNTs-5-FU組 mMWNTs-5-FU+外磁場組
第1天 1.652±0.064 1.725±0.029 4.055±0.740
第2天 1.310±0.332 3.937±0.861 5.294±0.114
第3天 1.078±0.081 6.178±0.672 9.111±0.737
第4天 1.007±0.371 3.161±0.593 4.427±1.955
第5天 0.962±0.408 2.719±0.878 3.563±0.876
第6天 0.645±0.053 1.536±0.430 3.547±1.501
第7天 1.421±0.097 2.632±0.784
第8天 1.179±0.254 1.787±0.859

3 討論
     磁性碳納米管混懸液具有一定的穩定性,與超聲震蕩時間有關,4小時為最佳時間,而且在外磁場下有很好的磁順應性,對5-FU有很好的緩釋作用。這在既往研究中[1]得以證實,混懸液注射鼠足墊后,相應三站引流淋巴結有很好的黑染示蹤效果,局部皮膚不會發生紅腫、潰爛及壞死等情況,碳納米管主要經腎臟代謝,未發現重要臟器聚集及病理反應,磁性碳納米管濃度高低對細胞的抑制無差別,而且抑制率很低,都顯示磁性碳納米管磁靶向藥物載體的低毒性。行為、食欲和精神上無明顯異常。說明這種載體無抗原性、對機體的刺激小和與生物體的相容性也比較好。既往LAM等[2-3]也證明小鼠體內無明顯的毒害作用。但也有研究[4-5]對其毒性尚持懷疑態度。
     從體外實驗結果分析,磁性多壁碳納米管對胃癌SGC7901細胞的殺傷效應不明顯,這與一些文獻的報道類似[6-7]。含相同濃度載附在磁性多壁碳納米管的5-FU與未載附在磁性多壁碳納米管的5-FU對胃癌SGC7901細胞的殺傷效應相似,但是他們對細胞的抑制率與阿霉素的濃度呈正相關。這兩者所含的5-FU旳濃度越大,其細胞的抑制率越大,這表明在體外,真正對SGC7901細胞起殺傷作用的是5-FU,并且與其有量效依賴關系。有學者研究提示這與磁性碳納米管的穿透性對5-FU的協助作用有關[8-9]。
     建立的足墊原發瘤+三站淋巴結轉移模型,成瘤率90%。在此基礎上研究以上靶向藥物,對于治療前后腫瘤體積的變化,C、D、E組與A、B組相比有統計學意義,C、D、E組腫瘤體積減小比較明顯,但這四組間腫瘤體積減少無明顯差異。研究表明磁性碳納米管可以作為淋巴靶向化療載體,對化療藥物有相應的控釋效應,對胃癌淋巴結轉移有明顯的抑制作用。YANG[10]和LU[11]均撰文磁性碳納米管載附吉西他濱和阿霉素對淋巴結癌轉移有抑制作用。靶向化療后重要臟器病理HE提示未見藥物載體沉積,抽血相關檢查未見異常,說明磁性多壁碳納米管作為藥物的載體可以減少化療藥物進入血液循環,從而降低全身不良反應。但也有個別持相反觀點的報道毒[12-13]。透射電鏡提示其能載附化療藥物進入細胞,可定位于胞漿空泡[14]。而細胞對顆粒的攝入導致細胞內活性氧的升高(Reactive Oxygen Species, ROS),進而攻擊細胞膜,損傷DNA,導致細胞凋亡[15]。總之磁性碳納米管作為新型的化療藥物載體的應用前景通過本實驗得到進一步證實[16]。
    

參考文獻
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